提到外泌体，这个直径仅 30-150nm 的 “纳米级囊泡”，如今已成为生命科学领域的 “明星分子”。它携带着细胞的核酸、蛋白、脂质等关键信息，在细胞间通讯、疾病诊断、药物递送等领域展现出巨大潜力。而想要解锁外泌体的研究价值，第一步也是最关键的一步 ——细胞上清外泌体提取，却常常让不少科研人 “卡脖子”。今天，我们就从实验原理到实操技巧，全方位拆解细胞上清外泌体提取的核心要点，帮你高效捕获这枚 “纳米信使”。

一、为什么要提取细胞上清外泌体？先搞懂它的 “独特价值”

在开始实验前，先明确一个问题：为什么科研界如此执着于从细胞上清中提取外泌体？

与组织来源的外泌体相比，细胞上清外泌体具有成分更单一、培养条件可控、易于大量获取的优势。无论是体外研究细胞间信号传递，还是制备标准化的外泌体试剂，细胞上清都是理想的起始材料。例如，在肿瘤研究中，通过提取癌细胞上清外泌体，可分析其携带的致癌 miRNA，为肿瘤标志物筛选提供依据；在干细胞研究中，干细胞上清外泌体的提取则是探索其旁分泌治疗机制的核心前提。

不过，细胞上清中的成分复杂，除了外泌体，还含有蛋白 aggregates、脂蛋白、游离核酸等 “杂质”，如何精准分离纯化，成为决定后续实验成败的关键。

二、3 类主流提取方法对比：选对方法，事半功倍

目前实验室常用的细胞上清外泌体提取方法有多种，每种方法的原理、效率和适用场景各不相同，盲目选择很容易导致外泌体得率低、纯度差。以下是 3 类主流方法的详细对比，帮你按需匹配：

1. 超速离心法：经典 “金标准”，适合追求高纯度

原理：利用外泌体与其他杂质的密度差异，通过多次超速离心（通常 100,000-120,000×g）实现分离。先通过低速离心（300-2,000×g）去除细胞碎片，再经高速离心（10,000-20,000×g）去除大囊泡，最后通过超速离心沉淀外泌体，必要时可结合蔗糖密度梯度离心进一步纯化。

优点：无需添加化学试剂，外泌体完整性好、纯度高，是很多高分文章中首选的方法。

缺点：对设备要求高（需超速离心机），耗时较长（单次实验需 6-8 小时），且得率相对较低，不适合大规模样本处理。

适用场景：对纯度要求高的实验，如外泌体蛋白组学、基因组学分析。

2. 聚合物沉淀法：快速便捷，适合新手入门

原理：通过添加聚乙二醇（PEG）等聚合物，降低外泌体在水溶液中的溶解度，使其从细胞上清中沉淀析出，再经低速离心收集沉淀。

优点：操作简单，无需特殊设备，耗时短（2-4 小时），得率高，适合处理大量样本。

缺点：沉淀中易混杂蛋白、脂蛋白等杂质，外泌体纯度较低，可能影响后续功能实验结果。

适用场景：初步筛选实验、外泌体得率统计，或作为后续纯化步骤的前处理。

3. 免疫亲和捕获法：精准靶向，适合特定亚型分离

原理：利用外泌体表面特异性标志物（如 CD63、CD81、TSG101）的抗体，通过免疫亲和作用将外泌体从细胞上清中捕获，再经洗脱获得纯化外泌体。

优点：特异性极强，可精准分离特定亚型的外泌体，纯度极高，能有效避免杂质干扰。

缺点：成本高（抗体价格昂贵），操作复杂，得率低，且受限于外泌体表面标志物的表达情况。

适用场景：特定功能外泌体的分离，如肿瘤特异性外泌体的捕获、外泌体亚型差异研究。

三、实操避坑指南：5 个关键细节，提升提取效率

无论选择哪种方法，实验过程中的细节把控都直接影响外泌体的质量。以下 5 个 “避坑要点”，一定要牢记：

1. 细胞上清预处理：去除杂质是前提

细胞培养上清收集后，需先进行预处理：

首先用 0.22μm 滤膜过滤，去除大囊泡和细胞碎片（避免堵塞超速离心管或影响沉淀效果）；

若上清中血清含量较高，建议先通过超速离心去除血清来源的外泌体（避免干扰细胞分泌外泌体的检测）；

预处理后的上清需尽快进行提取，若需保存，应置于 – 80℃冰箱，避免反复冻融（会导致外泌体破裂）。

2. 离心条件控制：速度和时间要精准

超速离心法中，离心速度需严格控制在 100,000-120,000×g，转速过低会导致外泌体无法沉淀，过高则可能破坏外泌体结构；

聚合物沉淀法中，PEG 浓度（通常为 8%-12%）和孵育温度（4℃孵育过夜可提高得率）需根据样本情况优化；

离心后收集的外泌体沉淀，应用无菌 PBS 轻轻重悬，避免剧烈吹打（防止外泌体破裂）。

3. 试剂选择：优先无外泌体成分

细胞培养时，应使用无外泌体血清（通过超速离心去除血清中的外泌体），避免血清外泌体对实验结果的干扰；

提取过程中使用的 PBS、离心管等耗材，需提前灭菌，避免微生物污染（外泌体易被细菌、真菌降解）。

4. 质量鉴定：提取后必做的 3 项检测

提取完成后，需通过以下 3 项检测验证外泌体的质量：

形态鉴定：通过透射电子显微镜（TEM）观察外泌体的典型杯状结构；

粒径分析：通过纳米颗粒跟踪分析（NTA）检测外泌体的粒径分布（30-150nm 为正常范围）；

标志物检测：通过 Western Blot 检测外泌体特异性标志物（如 CD63、CD81、TSG101），同时排除 Calnexin 等内质网蛋白（杂质标志）的表达。

5. 保存方式：短期与长期需区分

短期使用（1 周内）：可将外泌体重悬于无菌 PBS 中，置于 4℃冰箱保存；

长期保存（超过 1 周）：需分装后置于 – 80℃冰箱，避免反复冻融，建议添加 10% 甘油提高稳定性。

四、从实验室到临床：外泌体提取技术的未来方向

随着外泌体研究的深入，细胞上清外泌体提取技术也在不断升级。目前，科研人员正致力于开发更高效、更标准化的提取方法，例如：

微流控芯片技术：通过微通道设计实现外泌体的快速分离，减少试剂消耗和操作时间；

磁珠分选技术：结合免疫亲和与磁分离，提高外泌体的分离效率和纯度；

人工智能辅助优化：通过机器学习分析实验参数，实现提取条件的自动化优化。

这些技术的发展，不仅将推动外泌体基础研究的进步，也将为外泌体在疾病诊断、药物递送等临床领域的应用提供更有力的支持。