在细胞生物学和药效评价实验中，判断细胞是“主动死亡”还是“被动牺牲”非常关键。凋亡（Apoptosis）和坏死（Necrosis）是两种截然不同的死亡方式，涉及不同的分子机制和生理意义。尤其在药物毒性评估、抗肿瘤机制研究等领域，准确地区分凋亡与坏死是设计实验和解读结果的基础。

 

本篇将详细对比三种常用的细胞死亡染色方法，帮助你明确适用场景、原理差异和数据分析要点。

图片来源于“普拉特泽”公司官网

 

一、凋亡与坏死：你真的分得清吗？

 

特征	凋亡	坏死
发动方式	主动（程序性）	被动（意外损伤）
细胞膜	完整→最终破裂	早期即破裂
PS外翻	有	无显著特征
炎症反应	无	明显诱发
核染色	凝聚、碎裂	弥散、膨胀
可逆性	不可逆，但可被抑制	不可逆

 

因此，从膜完整性、PS外翻、DNA降解、酶活性变化等多个角度入手，才能更准确地区分凋亡与坏死。

 

 

二、三大经典染色方案对比

 

方案一：Annexin V-FITC / PI 双染法（流式细胞术）

 

✅ 原理：

 

Annexin V 结合凋亡细胞膜外翻的PS

PI 仅进入膜破裂的晚期凋亡或坏死细胞

 

✅ 实验优点：

 

快速、灵敏

区分正常、早期凋亡、晚期凋亡、坏死四类细胞

可用于活细胞状态分析，适用于流式细胞仪或荧光显微镜

 

✅ 分析方式：

 

象限	信号	细胞状态
Q4（Annexin– / PI–）	双阴	正常细胞
Q3（Annexin+ / PI–）	Annexin⁺	早期凋亡
Q2（Annexin+ / PI+）	双阳	晚期凋亡
Q1（Annexin– / PI+）	PI⁺	坏死

 

注意事项：

 

染色需避光、适当时间控制在15–20分钟内

Buffer需含Ca²⁺以支持Annexin结合

 

适用场景：

 

快速判断凋亡比例

药物毒性评估

剂量与时间依赖实验

 

 

方案二：Hoechst 33342 / PI 双染法（荧光显微镜）

 

✅ 原理：

 

Hoechst 33342穿透活细胞膜结合DNA，标记所有细胞核PI标记死亡或膜破裂细胞

 

✅ 实验优点：

 

可观察核染色形态学变化：凋亡细胞呈亮蓝色、核凝聚、碎裂适用于活细胞实时观察

 

✅ 数据解读：

 

染色模式	判断依据
Hoechst染色增强、核缩小	凋亡
Hoechst弱+PI阳性	坏死
双阳（Hoechst增强+PI）	晚期凋亡或继发坏死

 

 

注意事项：

 

染色浓度需严格控制，过量Hoechst可致毒性

显微观察较主观，需配合图像定量软件分析

 

适用场景：

 

细胞形态验证

与流式数据互补印证

低通量药效筛查

 

 

方案三：TUNEL 检测（荧光或免疫染色）

 

✅ 原理：

 

TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP Nick-End Labeling）法能标记凋亡过程中DNA链断裂的3′-OH末端，特异性识别**晚期凋亡细胞。

 

✅ 实验优点：

 

特异性强，直观反映DNA降解

可结合组织切片、石蜡标本进行原位染色

 

✅ 数据呈现：

 

TUNEL阳性细胞荧光增强，通常配合DAPI做核背景染色

结合组织形态分析凋亡分布

 

注意事项：

 

主要识别晚期凋亡，早期可能漏检

染色时间较长，需较强实验操作基础

需设置DNase处理阳性对照和无TdT阴性对照

 

适用场景：

 

组织病理样本分析

肿瘤组织凋亡定位

长期药物处理后的凋亡检测

 

 

三、三种方法对比总结

 

方法	检测类型	检测阶段	优点	局限性
Annexin V/PI	流式	早期+晚期凋亡、坏死	快速、定量	不适用于组织切片
Hoechst/PI	显微	形态+凋亡/坏死	实时观察、形态直观	主观性强、通量低
TUNEL	免疫染色	晚期凋亡	特异性高、适用于组织	检测周期长、漏检早期凋亡

 

 

四、组合使用才是王道

 

在实际研究中，仅凭单一染色方法往往难以全面掌握细胞死亡状态。推荐的组合策略包括：

 

流式 + 显微：Annexin V/PI流式快速筛查，Hoechst/PI验证凋亡形态

TUNEL + IHC双染：组织样本中同时标记凋亡细胞和特定细胞亚群

Annexin + 活性染料：结合Caspase 3/7活性探针，增强凋亡识别准确性

 

多角度染色验证，是建立科学结论的基础。

 

 

五、结语

 

在细胞凋亡与坏死的研究中，理解各类染色方案的本质差异，并根据实验目标和样本类型选择合适方法，才能获得可靠、精准的数据。别再让染色“走流程”，用好它们，你的实验就能看得更“透”！