RIP实验原理与流程：解析RNA与蛋白质相互作用的核心技术
在生命活动中，RNA与蛋白质的动态结合是基因表达调控、RNA代谢及信号转导的核心环节。RNA结合蛋白（RBP）通过与特定RNA分子结合，参与mRNA的剪接、转运、翻译及降解等过程，其异常调控与肿瘤、神经退行性疾病等密切相关。RNA免疫沉淀技术（RNA Immunoprecipitation, RIP） 作为研究RNA-蛋白质相互作用的经典方法，通过抗体特异性捕获目标蛋白及其结合的RNA，为解析RBP的功能提供了关键手段。本文将从实验原理、详细流程、关键注意事项及应用拓展四部分，系统介绍RIP技术的核心逻辑与操作要点。
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一、RIP实验原理：基于抗体特异性的“靶向捕获”策略
RIP技术的核心原理是免疫沉淀与RNA提取的结合，通过以下三个关键步骤实现RNA-蛋白质复合物的分离与鉴定：
- 抗原-抗体特异性结合
利用针对目标RBP的特异性抗体，与细胞裂解液中的RBP结合形成“抗体-RBP-RNA”三元复合物。抗体的高特异性是实验成功的基础，需确保其能识别天然状态下的靶蛋白（避免使用仅识别变性蛋白的抗体）。
- 免疫复合物的沉淀分离
通过 Protein A/G 磁珠（或琼脂糖珠）对“抗体-RBP-RNA”复合物进行沉淀。Protein A/G 可特异性结合抗体的Fc段，从而将目标复合物从复杂的细胞裂解液中分离出来。
- RNA的释放与鉴定
沉淀后，通过蛋白酶消化去除蛋白质，释放RNA，再通过逆转录PCR（RT-PCR）、高通量测序（RIP-Seq）或微阵列芯片（RIP-Chip）等技术鉴定与RBP结合的RNA序列。
二、RIP实验完整流程
RIP实验的流程可以简单归纳为：
1.收集细胞；
2.分离并裂解细胞核；
3.剪切片段化染色质；
4.将所研究的 RNA 结合蛋白 (RBP) 和结合的 RNA进行免疫沉淀；
5.洗涤、纯化免疫沉淀后 RBP 上结合的 RNA；；
阶段1：样品制备——细胞/组织的处理与裂解
核心目标：释放细胞内RNA-蛋白质复合物，同时保持其结合稳定性。
- 细胞收集与清洗
（1）贴壁细胞：用冷PBS洗涤细胞2次，加入细胞刮收集细胞，1500 rpm、4℃离心5 min，弃上清。
（2）悬浮细胞：直接离心收集，冷PBS洗涤2次。
（3）组织样品：新鲜组织用冷PBS清洗3次，匀浆器破碎为单细胞悬液后离心。
- 交联处理（可选）
若研究瞬时或弱相互作用，可加入甲醛（终浓度1%） 室温交联10 min，再用甘氨酸（终浓度0.2 M）终止交联，以增强RNA与蛋白的结合稳定性。
- 细胞裂解
（1）加入预冷的RIP裂解液，冰上静置10 min，使细胞膜破裂并释放RNA-蛋白质复合物。
（2）14,000 rpm、4℃离心10 min，取上清（含可溶性RNA-蛋白质复合物）备用。
阶段2：磁珠-抗体复合物的制备
核心目标：通过磁珠偶联抗体，为捕获目标RBP做准备。
- 磁珠平衡
（1）取50 μL Protein A/G磁珠，用RIP洗涤缓冲液洗涤2次，去除保存液；
（2）加入100 μL洗涤缓冲液重悬磁珠，加入5 μg特异性抗体（或IgG阴性对照），室温孵育30 min，使抗体与磁珠结合。
- 磁珠洗涤
用洗涤缓冲液洗涤磁珠-抗体复合物3次，去除未结合的游离抗体，避免后续非特异性干扰。
阶段3：免疫沉淀——捕获RNA-蛋白质复合物
核心目标：利用磁珠-抗体复合物特异性沉淀目标RBP及其结合的RNA。
- 样品与磁珠孵育
将阶段1制备的细胞裂解液上清（约1 mL）与磁珠-抗体复合物混合，4℃旋转孵育3 h至过夜，确保抗体充分结合目标RBP。
- 非特异性结合的去除
（1）孵育后，将离心管置于磁力架上，弃上清；
（2）用预冷的RIP洗涤缓冲液洗涤磁珠6次（每次涡旋混匀后静置5 min），彻底去除非特异性结合的蛋白质、RNA及杂质。
阶段4：RNA的提取与鉴定
核心目标：释放并纯化RNA，通过下游实验分析结合序列。
- 蛋白质消化与RNA释放
向磁珠中加入Proteinase K缓冲液（含蛋白酶K和SDS），55℃孵育30 min，消化蛋白质，释放RNA。
- RNA提取
（1）加入苯酚-氯仿-异戊醇（25:24:1）抽提RNA，13,000 rpm离心10 min，取上层水相；
（2）加入糖原（助沉淀剂）、醋酸钠（pH 5.2）及无水乙醇，-20℃静置2 h后离心沉淀RNA，75%乙醇洗涤后晾干，用DEPC水溶解。
- RNA质量检测与下游分析
（1）浓度与完整性：通过Nanodrop检测RNA浓度，Agilent Bioanalyzer评估RNA完整性（RIN值>7）；
（2）鉴定方法：
1）验证已知RNA：用RT-PCR检测目标RNA（如miRNA、lncRNA）的富集倍数（与IgG对照组比较）；
2）发现新RNA：通过RIP-Seq构建结合RNA的全基因组图谱，分析RBP的结合 motif 及功能通路。