外泌体提取是研究的基础，不同方法的原理、效率和适用场景差异显著。本文系统梳理 超速离心法、试剂盒沉淀法、密度梯度离心法、超滤法、磁珠免疫法和尺寸排阻色谱法的实验原理、操作流程，并通过 8项关键指标横向对比，帮你快速选择最适合的提取方案。

 

一、超速离心法（差速离心）：外泌体提取“金标准”

【实验原理】

基于颗粒沉降速度差异，通过逐步增加离心力（从低到高），依次去除细胞、碎片、微囊泡，最终在100,000g超速离心力下沉淀外泌体（外泌体沉降系数1.13-1.21g/mL）。

【核心流程】

以细胞上清为例

1. 预处理：300×g（10min）→ 2,000×g（20min）→ 10,000×g（30min），去除细胞和碎片；
2. 超速离心：100,000×g（70min，4℃）沉淀外泌体，PBS洗涤后再次100,000×g（70min）纯化；
3. 收集：沉淀用PBS重悬，-80℃保存。

 

优劣势

二、聚合物沉淀法（试剂盒法）：快速提取“新手首选”

【实验原理】

通过 PEG（聚乙二醇）等聚合物 竞争性结合水分子，降低外泌体溶解度，使其在低速离心（1,500-3,000×g）下与聚合物共沉淀（PEG分子量6000-8000效果最佳）。

【核心流程】

以ExoQuick试剂盒为例

1. 预处理：样本3,000×g（15min）去除碎片；
2. 沉淀：按1:5比例混合样本与沉淀试剂，4℃孵育12h（或30min快速沉淀）；
3. 离心：1,500×g（30min）收集沉淀，PBS洗涤去除残留PEG。

 

优劣势

 

三、密度梯度离心法：高纯度外泌体“进阶选择”

【实验原理】

在蔗糖/碘克沙醇密度梯度中，外泌体因密度（1.13-1.19g/mL）富集于特定梯度层，通过超速离心实现与杂蛋白、凋亡小体的分离。

【核心流程】

蔗糖密度梯度法

1. 制备梯度：依次叠加60%、50%、40%、30%蔗糖溶液，形成连续密度梯度；
2. 上样离心：样本加于梯度顶层，100,000×g（16h，4℃）；
3. 收集：取1.13-1.19g/mL密度层，PBS洗涤后离心沉淀。

 

优劣势

 

四、超滤法：快速浓缩“小体积样本首选”

【实验原理】

利用 100kD截留分子量超滤膜，通过离心力截留外泌体（粒径＞膜孔径），同时去除小分子杂质（蛋白、盐），实现浓缩与分离。

【核心流程】

1. 超滤浓缩：样本加入100kD超滤管，4,000×g（30min）浓缩至0.5mL；
2. 洗涤：加PBS重复超滤2次，去除残留杂质；
3. 收集：倒转超滤管离心，收集截留液（外泌体）。

 

优劣势

 

五、磁珠免疫捕获法：特异性提取“靶向研究首选”

【实验原理】

磁珠表面包被外泌体特异性抗体（如抗CD63、CD9），通过抗原-抗体结合捕获目标外泌体，磁场分离后洗脱获得高特异性外泌体。

【核心流程】

1. 孵育：磁珠与样本4℃孵育1h（抗体与外泌体结合）；
2. 分离：磁场吸附磁珠，PBS洗涤3次去除未结合杂质；
3. 洗脱：用酸性缓冲液（pH 2.0）洗脱外泌体，中和后收集。

 

优劣势

六、尺寸排阻色谱法（SEC）：临床样本“高活性首选”

【实验原理】

基于颗粒粒径差异，样本流经SEC色谱柱时，大粒径外泌体无法进入填料孔隙，先被洗脱；小分子杂质（蛋白、盐）进入孔隙，后被洗脱，从而分离纯化。

【核心流程】

以qEV柱为例

1. 上样：样本经0.22μm过滤后上样（0.5mL/柱）；
2. 洗脱：用PBS洗脱，收集第9-10个组分（外泌体富集峰）；
3. 浓缩：洗脱液超滤浓缩至所需体积。

 

优劣势

 

6大方法横向对比：8项指标帮你选