细胞铺板是细胞实验的“入门必修课”，看似简单却暗藏玄机——明明计数精准，孵育后却出现边缘密集、中间稀疏的“环岛现象”；或是复孔间细胞数量差异悬殊，直接影响后续MTT、CCK-8等实验数据。其实，铺板的核心在于“均匀分散”与“精准控制”。今天整理20条覆盖全流程的实战技巧，帮你轻松铺出“完美平板”。

一、铺板前准备：细节决定起点

1. 耗材提前“预热适配”：培养板、移液枪头需提前放入超净台紫外线照射30分钟；铺板前将培养板用无菌PBS润洗1遍，或加入少量培养基平衡温度，避免细胞接触冷板后立即贴壁。
2. 细胞状态“严格把关”：选择对数生长期细胞铺板，此时细胞增殖能力强、状态稳定；若细胞长满超过90%或出现接触抑制，需先传代1次再使用，避免铺板后生长停滞。
3. 计数前“充分混匀”：消化后的细胞悬液需用移液枪反复吹打10-15次，吹打时枪头贴壁，避免产生气泡；将细胞悬液分装到EP管中，每管取10μL用于计数，确保取样具有代表性。
4. 计数板使用“规范操作”：计数前用酒精棉擦拭计数板和盖玻片，滴加细胞悬液时让液体自然扩散，不要挤压；计数时只统计完整细胞，折光性强的死细胞和细胞碎片需排除。
5. 浓度计算“留有余地”：根据实验需求确定终浓度，配制细胞悬液时浓度比目标值高10%-15%，因为吹打和转移过程中会有少量细胞损耗；例如目标浓度为1×10⁴个/mL，可配制成1.1×10⁴-1.15×10⁴个/mL。

二、核心操作：精准控制每一步

1. 细胞悬液“现配现用”：配制好的细胞悬液需在30分钟内完成铺板，避免细胞沉降；若铺板时间较长，每10分钟轻轻颠倒离心管1次，防止细胞聚集在管底。
2. 移液枪“校准+控速”：铺板前校准移液枪，尤其是100μL以下量程；加样时枪头垂直对准培养孔中央，缓慢按下活塞，避免液体冲击孔底导致细胞分布不均。
3. 加样顺序“固定规律”：建议从培养板的第一行开始，按“从左到右、从上到下”的顺序加样，避免漏加或重复加样；每加完1列，将细胞悬液轻轻混匀1次，维持浓度稳定。
4. 孔内铺展“技巧性扩散”：加样后不要立即放入培养箱，将培养板在超净台内水平方向轻轻晃动3次，再垂直方向晃动3次，让液体均匀覆盖孔底；晃动时力度要轻，避免液体溅到孔外。
5. 边缘孔“特殊处理”：96孔板边缘孔易受温度波动影响，出现细胞生长异常，可在边缘孔加入无菌PBS而非细胞悬液，减少“边缘效应”；若必须使用边缘孔，需多设置2-3个复孔。
6. 不同孔板“调整策略”：6孔板铺板时，先在孔内加入2mL培养基，再加入细胞悬液，轻轻旋转培养板促进分散；24孔板则可直接加入细胞悬液，加样后用枪头轻轻划“十字”辅助均匀。
7. 避免“气泡干扰”：加样时若产生气泡，用移液枪枪头轻轻挑破，或轻轻敲击培养板侧壁让气泡浮起；气泡会阻碍细胞贴壁，导致局部无细胞生长。

三、孵育与后续：稳定细胞生长环境

1. 培养箱“平稳放置”：将培养板放入培养箱时，动作轻缓，避免剧烈晃动；培养板需水平放置，不要堆叠，确保每孔都能均匀接触CO₂环境，维持pH稳定。
2. 孵育初期“减少干扰”：铺板后4-6小时内不要移动培养板，此时细胞正处于贴壁关键期，移动会导致细胞位置改变，出现分布不均；若需观察，尽量在孵育6小时后进行。
3. 贴壁后“及时观察”：孵育12小时后用显微镜观察细胞分布情况，若出现局部密集，可轻轻吹打孔内培养基（贴壁细胞需谨慎，避免吹脱），促进细胞重新分布。
4. 换液时机“精准把控”：铺板后24小时进行第一次换液，去除未贴壁的死细胞和细胞碎片；换液时沿孔壁缓慢加入新培养基，避免冲击已贴壁的细胞。

四、特殊场景：针对性解决难题

1. 悬浮细胞“加强混匀”：悬浮细胞铺板时，细胞悬液浓度可适当提高，加样后每15分钟晃动1次培养板，连续3次，防止细胞沉降；也可使用专用的悬浮细胞培养板，减少细胞聚集。
2. 原代细胞“温和操作”：原代细胞活性较低，消化和吹打时动作要轻柔，铺板浓度比传代细胞高20%-30%；铺板前可在培养板表面包被多聚赖氨酸，促进细胞贴壁。
3. 高难度铺板“预实验摸索”：若需进行低浓度细胞铺板（如100个细胞/孔），先做预实验，调整细胞悬液浓度和加样体积，确保每孔细胞数量符合要求；可采用“梯度稀释法”配制细胞悬液，提高准确性。
4. 实验记录“详细完整”：记录细胞种类、传代次数、铺板浓度、加样体积、孵育时间等信息，若出现问题可快速追溯原因；复孔数据差异较大时，对比记录排查操作失误。

细胞铺板没有“捷径”，但有“方法”。从耗材准备到细胞悬液配制，从加样技巧到孵育管理，每一个细节的优化都能提升铺板质量。新手不必担心初期的不熟练，只要牢记这些技巧，多练习、多总结，就能逐步掌握“铺板手感”。你在细胞铺板中遇到过哪些棘手问题？欢迎在评论区留言，我们一起交流解决！