细胞转染是分子生物学和细胞实验中的基础核心技术，无论是过表达基因、敲低靶点，还是进行报告基因检测，都离不开高效的转染方法。然而，转染效率低、细胞毒性大、重复性差等问题常常让科研人头疼。

本文将从转染步骤、注意事项、常见问题及解决方案三个方面，带你系统掌握细胞转染技巧，助你实验顺利！

一、细胞转染详细步骤

1. 实验前准备

材料与试剂：

• 待转染细胞(如HEK293、HeLa等)
• 质粒DNA或siRNA/miRNA
• 转染试剂(如Lipofectamine 2000/3000、FuGENE HD等)
• Opti-MEM或无血清培养基
• 完全培养基和PBS缓冲液
• 6孔板、12孔板或24孔板(根据实验需求)

2. 具体操作步骤

第一天：细胞铺板

1. 取对数生长期的健康细胞，用胰酶消化并计数
2. 根据孔板规格接种适量细胞：

• 6孔板：0.5-1×10⁵细胞/孔
• 12孔板：2-5×10⁴细胞/孔
• 24孔板：1-2×10⁴细胞/孔

3. 加入完全培养基(含血清和抗生素)，置于37℃、5% CO₂培养箱中培养过夜
4. 目标转染时细胞融合度应达到70-90%(具体取决于细胞类型)

第二天：转染复合物制备与转染

1.质粒DNA准备：

• 取高纯度质粒DNA(OD260/280=1.8-2.0)
• 根据孔板规格确定DNA用量：
• 6孔板：2-4μg/孔
• 12孔板：1-2μg/孔
• 24孔板：0.5-1μg/孔

2.转染试剂准备：

• 将转染试剂室温平衡15-30分钟
• 根据说明书确定转染试剂与DNA比例(通常Lipofectamine 2000为2-3μl:1μg DNA)

3.转染复合物制备：

• 在无菌EP管A中加入适量Opti-MEM(如50μl)，再加入质粒DNA，轻轻混匀
• 在无菌EP管B中加入等量Opti-MEM(如50μl)，再加入转染试剂，轻轻混匀，室温静置5分钟
• 将A管和B管溶液混合，轻柔吹打混匀，室温静置15-20分钟形成DNA-脂质体复合物

4.细胞处理：

• 吸去孔板中的旧培养基，用PBS轻柔洗涤一次(某些转染试剂可省略此步)
• 加入新鲜无血清培养基或含少量血清的培养基(2% FBS)

5.加入转染复合物：

• 将制备好的转染复合物逐滴均匀加入孔中，轻柔摇晃培养板混匀
• 放回CO₂培养箱中培养4-6小时后更换为完全培养基(视细胞耐受性而定)

第三天及后续：观察与检测

1.转染后24小时开始观察细胞状态和荧光表达情况(如使用报告基因)

2.根据实验目的在转染后24-72小时进行后续实验：

• 蛋白水平检测：通常48-72小时后收集细胞
• mRNA水平检测：通常24-48小时后收集细胞

二、注意事项

1. 细胞状态关键点

• 使用对数生长期的健康细胞，传代次数不宜过多
• 避免细胞过度融合或过少，理想融合度为70-90%
• 某些敏感细胞系需在转染前更换新鲜培养基

2. DNA质量要求

• 使用高纯度质粒(推荐使用质粒提取试剂盒)
• 避免内毒素污染(重要实验建议使用无内毒素提取试剂盒)
• DNA浓度应准确测定，避免RNA或蛋白污染

3. 转染条件优化

• 初次实验需进行DNA与转染试剂比例梯度测试
• 不同细胞系需优化转染条件(如HepG2、原代细胞等难转染细胞)
• 考虑使用增强剂(如FuGENE HD搭配Enhancer)

4. 其他重要注意事项

• 严格无菌操作，避免污染
• 转染复合物制备时避免剧烈涡旋
• 转染后换液时间需根据细胞耐受性调整
• 设置适当的阳性和阴性对照

三、常见问题及解决方案

1. 转染效率低

可能原因：

• 细胞状态不佳
• DNA质量差或浓度不准确
• 转染试剂与DNA比例不当
• 细胞密度不合适

解决方案：

• 使用新鲜传代的健康细胞
• 重新提取质粒并准确测定浓度
• 进行比例优化实验(如1:1,1:2,1:3 DNA:转染试剂)
• 测试不同细胞密度下的转染效果

2. 细胞毒性明显

可能原因：

• 转染试剂用量过大
• 转染复合物与细胞作用时间过长
• 血清浓度不足

解决方案：

• 减少转染试剂用量
• 4-6小时后及时更换完全培养基
• 尝试含2-5%血清的培养基进行转染

3. 实验重复性差

可能原因：

• 细胞传代次数不一致
• 实验操作不规范
• 试剂批次差异

解决方案：

• 使用相同代数的细胞进行实验
• 固定实验操作人员和流程
• 使用同一批次的转染试剂和培养基

4. 特殊细胞转染困难

难转染细胞类型：

• 原代细胞
• 悬浮细胞
• 某些肿瘤细胞系(如HepG2)

解决方案：

• 尝试不同转染试剂(如Lipofectamine 3000对难转染细胞效果较好)
• 使用电穿孔法或病毒转导
• 添加转染增强剂
• 对于悬浮细胞，可采用离心辅助转染(离心fection)

四、高级技巧与替代方案

1. 稳定转染筛选

• 进行常规转染后，加入适当浓度的筛选抗生素(如G418、嘌呤霉素等)
• 每3-4天更换含抗生素的培养基，持续2-3周
• 挑取单克隆扩大培养

2. siRNA/miRNA转染

• 使用专门设计的RNA转染试剂
• siRNA工作浓度通常为20-100nM
• 转染后24-72小时进行检测(取决于靶基因半衰期)

3. 高通量转染

• 使用96孔板优化条件
• 考虑采用自动化液体处理系统
• 使用适合高通量的转染试剂(如Lipofectamine RNAiMAX)

4. 替代转染方法

• 电穿孔：适用于难转染细胞，需优化电压和脉冲时间
• 病毒转导：适合原代细胞，需注意生物安全
• 纳米颗粒转染：新型方法，毒性较低
• 显微注射：用于单个细胞转染，技术要求高

六、安全注意事项

1.涉及病毒载体的转染需在相应生物安全级别实验室进行

2.处理人类来源细胞需遵循生物安全规范

3.质粒携带抗生素抗性基因时需妥善处理废弃物

4.使用siRNA时注意避免非特异性效应

 

细胞转染是分子细胞生物学研究的基础技术，成功的转染实验依赖于优质的细胞状态、高纯度的核酸、合适的转染条件和规范的操作流程。针对不同细胞类型和研究目的，需要优化转染方案。当常规方法效果不佳时，可考虑替代转染策略。记录详细的实验条件和结果对于提高实验可重复性至关重要。随着技术进步，新型转染试剂和方法不断涌现，研究者应根据实验需求选择最适合的转染策略。