细胞周期分析实战指南：从染色到分型
细胞周期是细胞增殖、分裂的基础，对理解肿瘤生长、药物机制、细胞生物学等研究领域具有核心价值。利用流式细胞术（Flow Cytometry）结合PI（碘化丙啶）染色，可以快速、准确地分析细胞在不同周期（G0/G1、S、G2/M）阶段的分布，是实验室中最常用的一种周期分析方法。
这篇文章将为你梳理细胞周期检测的原理、实验流程、关键参数设置、数据分析方法，并附上常见问题的应对方案，助你快速掌握细胞周期实验的完整思路。
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一、细胞周期分析的基本原理
细胞周期分为四个阶段：
G0/G1期：细胞休眠或生长准备期，DNA含量为2N；
S期：DNA合成期，DNA含量在2N\~4N之间；
G2/M期：细胞准备分裂或正在分裂，DNA含量为4N。
在流式检测中，我们通过染色DNA来评估细胞内DNA的相对含量，从而推断其处于哪个周期阶段。
常用的DNA染料包括：
PI（Propidium Iodide）：经典染料，穿透膜后嵌入双链DNA，适用于固定细胞；
Hoechst 33342：适用于活细胞实时染色；
DAPI：常用于免疫组化和固定细胞染色，但对流式不如PI常用。
本指南重点讲解 PI 染色法。
二、实验步骤详解（PI法）
- 细胞收集与处理
取对数生长期细胞（贴壁或悬浮均可）；
使用胰酶温和消化贴壁细胞，合并上清中漂浮细胞；
用 PBS 洗涤 1 次，转入 EP 管中，保持细胞浓度约 1×10⁶ 个/mL。
> 建议提前设置：空白对照、同步化处理组、药物处理组等。
- 细胞固定（关键步骤）
加入70%预冷乙醇，边滴加边涡旋混匀，使细胞均匀固定；
放置在 4℃ 冰箱中 固定至少 2 小时（或过夜）。
> 固定有助于膜通透性提升，使染料进入细胞内部。
- 染色步骤
固定后，离心弃上清；
用 PBS 洗涤 1–2 次，去除乙醇残留；
重悬于染色液（建议如下配方）：
染色液推荐配方（每样本 500 μL）：
PI：50 μg/mL
RNase A：100 μg/mL（消除RNA干扰）
PBS 或 Binding Buffer
避光孵育 30 分钟（室温或37℃均可），随后上机检测。
三、流式检测设置与参数调节
✅ 检测通道设置
激光通道：PI 使用 488 nm 激光（红色通道）；
FL2 或 PE 通道（通常）用于收集 PI 荧光信号。
✅ 数据采集建议
线性放大（Linear Scale）比对数放大更适用于周期分析；
建议每组至少采集 1 万个细胞事件；
保持仪器电压、电流稳定，设定一致性。
四、数据分析策略（以 FlowJo 为例）
1建立细胞总群门（FSC/SSC）
先在 FSC（前向散射）和 SSC（侧向散射）图上选择单个细胞群，排除碎片和聚团。
2剔除双峰细胞（Doublet discrimination）
通过 PI 宽度 vs 面积（PI-W vs PI-A）图，筛选单个细胞，排除双峰聚集细胞，以免干扰分析。
3DNA含量分析
使用直方图（Histogram），观察 DNA 含量分布图，出现典型的“三峰”：
G0/G1 峰（左峰）
S 期斜坡区域（中间）
G2/M 峰（右峰）
4拟合周期分布
使用 FlowJo 的“Cell Cycle”模块进行建模拟合（模型一般选择 Watson 或 Dean-Jett-Fox），输出各期所占比例：
G0/G1 %
S %
G2/M %
五、常见应用场景举例
| 实验类型 | 细胞周期应用 |
| 抗肿瘤药物研究 | 检测细胞是否阻滞在特定周期 |
| DNA损伤机制研究 | 判断周期改变是否与DNA复制修复相关 |
| 干细胞生物学 | 比较周期状态与分化潜能 |
| 同步化实验 | 使用血清饥饿、双胸腺嘧啶（thymidine）等同步方法检测周期恢复情况 |
六、常见问题排查指南
| 问题 | 可能原因 | 解决建议 |
| 周期图不清晰、无峰 | 未除RNA，PI染色非特异 | 确保加入足量 RNase A，37℃充分消化 |
| S 期识别不准确 | 双峰未剔除 | 做好双峰细胞剔除（PI-W vs PI-A） |
| G1/G2 峰重叠严重 | 细胞状态不佳、固定不充分 | 保证细胞健康，乙醇充分固定且慢慢加入 |
| PI染色过弱或太亮 | 染料浓度不当、孵育不足 | 调整染色液浓度，避光孵育 30–60 分钟 |
七、提升周期分析质量的实用技巧
提前同步化细胞可提高分析效率，如血清饥饿同步48h；
使用含 RNase 的即用型 PI 染液可省步骤减少误差；
每次实验务必设置阴性对照和染料空白；
将周期分析与增殖标记（如 Ki67、EdU）或凋亡染色结合，可获取更丰富的生物学信息。
八、总结
细胞周期分析虽属于经典实验，但要真正做到结果可靠、分型清晰，并非“染染上机”这么简单。从样本准备、染色、固定、流式设置到数据拟合，每一步都至关重要。
尤其在抗癌药筛选、放疗机制研究、细胞功能分型等项目中，高质量的周期分析是不可或缺的数据支撑。