在分子生物学实验室，有这样一种试剂：它既是DNA的溶剂”，又是蛋白质电泳的”稳定基石”；既能调节溶液酸碱度，又能参与生物分子的晶体生长——它就是Tris-HCl缓冲液。从PCR反应到蛋白质纯化，从核酸电泳到细胞培养，这种看似简单的缓冲液，却支撑着无数实验的顺利进行。本文将系统解析Tris-HCl缓冲液的核心特性、配制方法及实验应用，帮你彻底掌握这个生物实验的功臣”。

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一、认识Tris：缓冲液中的”多面手”

Tris的化学本质：三羟甲基氨基甲烷（Tris(hydroxymethyl)aminomethane），分子式(HOCH₂)₃CNH₂，是一种有机弱碱。在25℃时pKa值为8.1，这意味着它的有效缓冲范围在pH7.0-9.2之间，恰好覆盖了大多数生物分子的稳定pH区间（如蛋白质稳定pH通常为6.0-8.0，DNA为7.0-8.5）。

为什么Tris-HCl是实验室首选？

• 低离子强度：对蛋白质结构和酶活性影响小，适合作为生物大分子的溶剂
• 温度敏感性：温度每升高1℃，pH值降低约03个单位，可通过温度调节精确控制pH
• 兼容性强：能与EDTA、硼酸等配制成TE、TAE等复合缓冲液，满足不同实验需求
• 制备简单：仅需Tris碱和盐酸即可配制，无需复杂原料

Tris的”家族成员”：通过改变中和酸的种类，可衍生出多种缓冲液：

• Tris-HCl：最基础款，用于蛋白质溶解、细胞裂解
• TE缓冲液（Tris+EDTA）：保护DNA免受核酸酶降解
• TAE缓冲液（Tris+乙酸+EDTA）：核酸电泳常用，分辨率高
• TBE缓冲液（Tris+硼酸+EDTA）：DNA测序首选，缓冲能力强

二、核心攻略：Tris-HCl缓冲液的配制方法

配制Tris-HCl缓冲液的核心是通过盐酸调节Tris碱溶液的pH值。以下是实验室最常用的浓度及pH值的详细配制步骤，新手也能一次成功！

（一）基础款：1M Tris-HCl缓冲液（pH7.4/7.6/8.0）

应用场景：蛋白质提取、Western blot转膜缓冲液、细胞培养液基础组分
配制原理：1M Tris溶液pH约为10.5，需加入浓盐酸中和至目标pH

【配制步骤】

1. 称量溶解：称取1g Tris碱（分子量121.14），置于1L烧杯中，加入800ml去离子水，磁力搅拌至完全溶解（溶液澄清透明）。
2. pH调节：用pH计监测，逐滴加入浓盐酸（12M HCl），边加边搅拌，按目标pH值控制盐酸用量：

• 4：约加70ml浓盐酸
• 6：约加60ml浓盐酸
• 0：约加42ml浓盐酸
  ⚠️关键提示：必须在溶液冷却至室温后再定容pH！温度对Tris的pH影响极大，热溶液调pH会导致室温时pH偏低0.3-0.5个单位。
  3. 定容灭菌：将溶液转移至1L容量瓶，加去离子水定容至刻度，混匀后分装，121℃高压灭菌20分钟，室温保存。

【常见问题】

• pH值漂移：若灭菌后pH下降2以内属正常现象，可在配制时将目标pH提高0.2个单位预补偿
• 结晶析出：低温保存时Tris可能结晶，37℃水浴加热即可溶解，不影响使用

（二）高浓度款：1.5M Tris-HCl（pH8.8）

应用场景：SDS-PAGE凝胶配制（分离胶pH需8.8，浓缩胶用pH6.8 Tris-HCl）
配制特点：更高浓度的Tris可提供更强的缓冲能力，维持凝胶电泳过程中的pH稳定

【配制步骤】

1. 称取7g Tris碱（1.5mol），加入800ml去离子水搅拌溶解
2. 用浓盐酸调节pH至8（约需55-60ml），冷却至室温后定容至1L
3. 无需灭菌（凝胶配制时需加丙烯酰胺等试剂，最终需过滤除菌），4℃保存

【凝胶配制中的关键作用】

在聚丙烯酰胺凝胶中，Tris-HCl不仅稳定pH，还与甘氨酸形成缓冲体系：电泳时甘氨酸在pH8.8的分离胶中解离为负离子，带动蛋白质迁移；进入pH6.8的浓缩胶后，甘氨酸解离度降低，蛋白质被压缩成紧密条带，实现高效分离。

（三）低浓度款：0.1M Tris-HCl（pH7.5）

应用场景：酶反应缓冲液、蛋白质洗脱液、抗体稀释液
配制优势：低离子强度减少对酶活性的抑制，适合精细的生化反应

【配制步骤】

1. 称取11g Tris碱，加入800ml去离子水溶解
2. 用1M HCl（而非浓盐酸）缓慢调节pH至5（约需85ml），避免局部过酸导致pH骤降
3. 定容至1L，22μm滤膜过滤除菌（适用于对无菌要求高的酶反应），4℃保存

【浓度换算公式】

若需配制其他浓度（如0.05M、2M），可按以下公式计算Tris碱用量：
所需Tris质量（g）= 目标浓度（mol/L）× 体积（L）× 121.14（分子量）

（四）复合缓冲液：TE、TAE、TBE的配制

Tris-HCl常与EDTA等试剂配伍，形成功能更专一的缓冲液：

1. TE缓冲液（10mM Tris-HCl + 1mM EDTA，pH8.0）

核心功能：DNA保存液（EDTA螯合Mg²⁺，抑制核酸酶活性）
配制方法：

• 取10ml 1M Tris-HCl（0）和2ml 0.5M EDTA（pH8.0），加去离子水定容至1L
• 高压灭菌后室温保存，DNA样品可在TE中4℃短期保存或-20℃长期保存

2. TAE缓冲液（40mM Tris-乙酸 + 1mM EDTA，pH8.3）

核心功能：琼脂糖凝胶电泳（适合分离大片段DNA，如基因组DNA）
50×浓缩液配制：

• 242g Tris碱 + 57.1ml冰乙酸 + 100ml 0.5M EDTA（0），定容至1L
• 使用时用去离子水稀释50倍，工作液pH约3

3. TBE缓冲液（89mM Tris-硼酸 + 2mM EDTA，pH8.3）

核心功能：DNA测序、小片段DNA电泳（缓冲能力强，不易出现pH梯度）
10×浓缩液配制：

• 108g Tris碱 + 55g硼酸 + 40ml 0.5M EDTA（0），定容至1L
• 稀释10倍后使用，注意：长期使用会在电泳槽中析出硼酸结晶，需定期更换

三、实验应用：Tris-HCl缓冲液的”万能场景”

Tris-HCl缓冲液凭借其独特的理化性质，在分子生物学实验中应用广泛，以下是典型场景的使用指南：

1. 核酸提取与纯化

• 细胞裂解：0的Tris-HCl缓冲液（含EDTA和去污剂）可破坏细胞膜，同时抑制核酸酶活性。例如，提取细菌基因组DNA时，常用50mM Tris-HCl（pH8.0）+10mM EDTA的缓冲液，EDTA能螯合Mg²⁺，阻止DNase（依赖Mg²⁺的核酸酶）降解DNA。
• DNA溶解：TE缓冲液（10mM Tris-HCl pH8.0 + 1mM EDTA）是DNA的”最佳溶剂”。DNA在弱碱性环境中更稳定，EDTA可长期抑制残留核酸酶活性，-20℃保存可稳定数年。
• 电泳分离：

• 琼脂糖凝胶电泳：常用TAE缓冲液（3），适合分离大片段DNA（如基因组DNA、质粒），其低离子强度可减少电流产热，保护DNA完整性；
• 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：用于小片段DNA（如寡核苷酸、PCR产物）分离，需用TBE缓冲液（3），硼酸能增强缓冲能力，避免电泳过程中pH波动影响分离效果。

2. 蛋白质研究
   • 蛋白质提取：4-7.6的Tris-HCl缓冲液（20-50mM）是常规选择。例如，提取细胞总蛋白时，缓冲液中加入NaCl（150mM）可维持生理离子强度，减少蛋白质聚集；加入蛋白酶抑制剂（如PMSF）可保护蛋白质不被降解。
   • SDS-PAGE凝胶配制：

• 分离胶：5M Tris-HCl（pH8.8），高浓度Tris提供强缓冲能力，确保电泳过程中pH稳定，使蛋白质按分子量大小分离；
• 浓缩胶：5M Tris-HCl（pH6.8），与电极缓冲液（Tris-甘氨酸，pH8.3）形成pH梯度，将蛋白质样品压缩成紧密条带，提高分离分辨率。
  • 酶活性测定：低浓度Tris-HCl（10-50mM，5-8.0）常用于酶反应体系。例如，测定DNA聚合酶活性时，Tris-HCl缓冲液可维持反应pH稳定，且不干扰酶与底物的结合（离子强度低，避免竞争性抑制）。

3. 细胞培养与组织工程

• 培养基pH调节：Tris-HCl缓冲液的pKa值（06）接近细胞培养常用pH（7.2-7.4），可有效抵抗培养基因代谢产生的酸性物质（如CO₂、乳酸），维持pH稳定。例如，无血清培养基中常添加20mM Tris-HCl（pH7.4），配合HEPES使用可增强缓冲效果。
• 细胞洗涤与消化：胰蛋白酶消化细胞时，常用05%胰酶+0.53mM EDTA的Tris-HCl缓冲液（pH7.4），温和的离子环境减少对细胞活性的影响；洗涤细胞时，PBS缓冲液（含Tris-HCl）可快速去除残留培养基成分。
• 三维细胞培养：Tris-HCl缓冲液的低离子强度适合纤维蛋白凝胶的形成，在干细胞分化实验中，常通过调节Tris-HCl浓度（50-100mM）控制凝胶硬度，模拟体内微环境。

4. 分子诊断与检测

• PCR反应体系：标准PCR缓冲液含10mM Tris-HCl（3，25℃），反应升温至95℃时pH降至7.2左右，接近Taq DNA聚合酶的最适pH（7.5），确保酶活性最大化。
• 免疫印迹（Western blot）：转膜缓冲液需用25mM Tris-HCl（3）+192mM甘氨酸+20%甲醇，Tris与甘氨酸形成缓冲对，维持转膜过程中电场稳定，甲醇可增强蛋白质与膜的结合力。
• ELISA检测：包被缓冲液常用50mM Tris-HCl（6），弱碱性环境促进抗原抗体吸附；洗涤缓冲液（PBST）中加入0.05% Tween-20和Tris-HCl（pH7.4），可减少非特异性结合，提高检测灵敏度。

5. 特殊实验场景

• 蛋白质复性与重折叠：Tris-HCl缓冲液（0，50mM）因良好的溶解性和适宜离子强度，常用于变性蛋白质的复性。例如，包涵体蛋白复性时，缓冲液中加入尿素（6-8M）和还原剂（DTT），Tris-HCl可维持复性过程中的pH稳定，减少蛋白质聚集。
• 金属离子检测：Tris-HCl缓冲液不与钙、镁等金属离子反应，适合作为酶法检测金属离子的缓冲体系。例如，测定血清钙含量时，Tris-HCl缓冲液可避免金属离子沉淀，确保显色反应准确。

四、避坑指南：配制与使用的关键注意事项

1. 温度对pH的影响：
   Tris的pH值随温度变化显著（温度每升高1℃，pH降低03）。例如，4℃冰箱保存的1M Tris-HCl（pH8.0），取出至37℃温育后pH会降至7.7左右。解决方案：配制时在实验温度下调节pH（如细胞培养需37℃调pH，低温实验需4℃调pH）。
2. 浓度与缓冲能力：
   缓冲液浓度需根据实验需求调整：酶反应常用10-50mM，避免高浓度抑制酶活性；电泳或细胞培养需20-100mM，确保缓冲能力。警惕：浓度低于5mM时，Tris-HCl缓冲能力显著下降，易受外界酸碱干扰。
3. 灭菌与保存：

• 用于细胞培养或酶反应的缓冲液需过滤除菌（22μm滤膜），避免高压灭菌破坏成分；
• 含EDTA的缓冲液（如TE、TAE）可高压灭菌，但需冷却后调pH，防止EDTA高温分解；
• 配好的缓冲液室温保存不超过6个月，4℃可延长至1年，出现浑浊或沉淀需丢弃。
  4. 避免与金属离子反应：
     Tris-HCl虽不与钙、镁等常见离子反应，但会与重金属（如Cu²⁺、Fe³⁺）形成络合物。若实验涉及金属离子，需提前用EDTA螯合去除，或改用PBS缓冲液。