外泌体鉴定之Western Blot：电泳技术核心原理与实验流程
Western Blot（WB）是外泌体鉴定的“金标准”之一，通过检测CD63、CD81、TSG101等标志性蛋白，结合阴性对照（如Calnexin）验证外泌体纯度。其中，电泳步骤是分离外泌体蛋白、确保条带清晰的关键。本文详细解析外泌体WB电泳的核心原理、凝胶选择、操作流程及常见问题解决方案，帮你轻松获得理想结果。
一、外泌体WB电泳的核心原理：按分子量分离蛋白
外泌体蛋白需通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，其原理基于 “电荷效应”和“分子筛效应”：
- 电荷效应：SDS使蛋白带负电
- 外泌体蛋白与 SDS（阴离子去污剂）结合（1分子蛋白结合4分子SDS），掩盖天然电荷，使所有蛋白带 均匀负电荷，电泳时仅按分子量大小迁移。
- 还原剂（如β-巯基乙醇）断裂蛋白二硫键，破坏空间结构，确保蛋白线性化，迁移速率仅与分子量相关。
- 分子筛效应：凝胶孔径决定分离范围
– 聚丙烯酰胺凝胶由浓缩胶和分离胶组成：
– 浓缩胶（pH 6.8）：孔径大，样品在此被压缩成“薄层”，减少条带扩散；
– 分离胶（pH 8.8）：孔径小，分子量差异大的蛋白分离效果更显著（如CD63/53kDa与TSG101/45kDa）。
二、凝胶浓度选择：根据外泌体标志物分子量精准匹配
外泌体标志物分子量差异大（24-95kDa），需根据目标蛋白选择合适的分离胶浓度，确保条带清晰分离：
三、详细实验流程：从样本处理到电泳结束
- 外泌体蛋白提取与定量
（1）蛋白提取
– 外泌体沉淀用 RIPA裂解液（含1% SDS、蛋白酶抑制剂）重悬，冰上裂解30分钟（期间涡旋3次，每次10秒）；
– 12,000×g离心（4℃，10分钟），取上清（避免未裂解的囊泡沉淀干扰）。
（2）BCA定量
– 按BCA试剂盒说明书操作，测定蛋白浓度（外泌体蛋白浓度通常为0.1-1μg/μL）；
– 根据目标蛋白丰度调整上样量：高丰度标志物（如CD63）上样5-10μg，低丰度标志物（如CD81）上样10-20μg。
- 样品变性与上样
（1）变性处理
– 按 4:1比例混合蛋白样品与5×Loading Buffer（含SDS、β-巯基乙醇），95℃加热5分钟（彻底变性），冰上冷却5分钟。
（2）上样技巧
– 用微量注射器缓慢将样品注入加样孔（避免气泡），每孔上样体积≤20μL（避免溢出）；
– 左侧加 蛋白Marker（如10-180kDa），用于分子量参考；右侧留1-2个空白孔（加等量Loading Buffer，排除背景干扰）。
- 电泳参数设置与运行
（1）浓缩胶阶段（低电压压缩样品）
– 恒压 80V，电泳30-40分钟，至溴酚蓝（Loading Buffer指示剂）进入分离胶（约距浓缩胶-分离胶界面1cm）。
（2）分离胶阶段（高电压分离蛋白）
– 调整电压至 120V，继续电泳60-90分钟，至溴酚蓝距凝胶底部1cm时停止（避免小分子蛋白跑出胶外）。
- 电泳结束后处理
– 小心剥离凝胶，放入 转膜缓冲液 中平衡10分钟（避免胶干裂），准备转膜。
四、常见问题与解决方案：电泳条带异常的“急救指南”
- 条带模糊/弥散（最常见问题）
– 可能原因：
① 凝胶浓度不当（如用8%胶分离24kDa的CD9，孔径过大导致条带扩散）；
② 上样量过高（＞20μg，蛋白过载）；
③ 加热变性不充分（蛋白未完全线性化）。
– 解决方案：
– 按分子量选择凝胶浓度；
– 降低上样量（如10μg），或增加凝胶厚度（1.5mm胶代替1mm胶）；
– 95℃加热时间延长至7分钟，确保彻底变性。
- 条带歪斜/弯曲
– 可能原因：
① 凝胶聚合不均匀（TEMED或AP浓度不当）；
② 电泳槽缓冲液液面不一致（内槽液面低于外槽，导致电场不均匀）。
– 解决方案：
– 现配凝胶，TEMED和AP按比例添加（10mL胶加5μL TEMED、50μL 10% AP）；
– 确保内槽缓冲液淹没凝胶上沿，外槽缓冲液没过电极。
- Marker条带不清晰
– 可能原因：Marker未充分变性（未加热或加热时间不足）；
– 解决方案：Marker单独加热（95℃，5分钟），上样前混匀。
- 无条带（电泳阶段问题）
– 可能原因：
① 电极接反（蛋白向反方向迁移出胶）；
② 电泳时间过长（溴酚蓝跑出胶外，小分子蛋白丢失）。
– 解决方案：
– 确认电极正负极（红色接正极，黑色接负极）；
– 密切观察溴酚蓝位置，提前5分钟停止电泳。
五、关键注意事项：确保电泳结果可重复
- 凝胶质量：现配现用，避免反复冻融（AP易失效）；
- 缓冲液：SDS电泳缓冲液可重复使用2-3次，pH需维持在8.3（超过8.5需重新配制）；
- 温度控制：电泳时凝胶温度＜30℃（温度过高会导致条带弥散），可打开电泳槽盖散热；
- 记录参数：详细记录凝胶浓度、电压、电泳时间，确保实验可重复。