导读： 离心超滤管（Centrifugal Filter Units）是生物化学和分子生物学实验中用于蛋白、核酸浓缩、脱盐、缓冲液置换的关键工具。然而，看似简单的超滤操作，其中却隐藏着许多影响回收率和实验结果的细节。本文将以 15 个常见问题（FAQ） 的形式，为您提供一份关于超滤管选择、预处理和使用的超全指南，助你高效获取高质量浓缩样本。

一、基础知识与选择篇（Q1-Q5）

Q1：超滤管的核心原理是什么？

A： 离心超滤基于**分子量截留（Molecular Weight Cut-Off, MWCO）**原理。超滤管底部有一层半透膜，只允许小于 MWCO 的分子（如水、小分子缓冲盐）在离心力作用下通过滤膜，而大于 MWCO 的目标分子（如蛋白、核酸）则被截留在滤膜上方，从而达到浓缩和置换缓冲液的目的。

Q2：如何选择合适的 MWCO？

A： MWCO 的选择是超滤成功的关键。原则上，MWCO 应为目标分子分子量的 1/3 到 1/6。

目标分子量	推荐 MWCO 范围	常见应用
< 10 kDa	1-3 kDa	肽段、小分子蛋白
10-30 kDa	3-10 kDa	小型酶、抗体片段
30-100 kDa	10-30 kDa	抗体（IgG 约 150 kDa，选 30/50 kDa）

选择过大的 MWCO 会导致目标分子大量损失（穿滤）；选择过小则会延长离心时间，并可能导致膜堵塞。

Q3：市面上的膜材料有哪些？应该如何选择？

A： 常见的膜材料包括：

• 聚醚砜（PES）：流速快，非特异性吸附相对较低，是最常用的通用膜材料。
• 再生纤维素（RC）：兼容性广，适合蛋白或核酸浓缩，但吸附性可能略高于 PES。
• 聚偏氟乙烯（PVDF）：通常用于某些特定应用或疏水性分子的过滤。

选择建议： 对于大多数蛋白浓缩，优先选用 PES 或 RC 材质。

Q4：超滤管的最大体积和最小回收体积如何理解？

A：

• 最大体积（Max Volume）：指超滤管能容纳的最大样品体积，应避免装载超过此体积，否则离心时样品可能溢出。
• 最小回收体积（Min Concentrated Volume）：指浓缩完成后，超滤膜上方残留的最小样品体积。低于此体积可能会因膜的吸附或蒸发导致样品完全损失，一般在 10 L 到 50 L 之间。

Q5：超滤管是否可以重复使用？

A： 不建议。超滤管通常设计为一次性使用。重复使用可能存在以下问题：

1. 交叉污染。
2. 清洗残留导致下一批样品性能下降。
3. 离心力对膜造成不可逆损伤，影响 MWCO 精度和流速。

二、预处理与操作篇（Q6-Q11）

Q6：超滤前必须进行预处理（润洗）吗？

A： 强烈建议。 预处理，特别是对新批次的超滤管，可以去除膜表面可能残留的少量甘油、防腐剂或其他化学物质，同时能最大限度地减少膜对蛋白质的非特异性吸附。

Q7：超滤管如何正确润洗？

A：

1. 加入适量的超纯水或目标缓冲液（例如 PBS）。
2. 以超滤管建议的离心力（RCF）离心 3-5 分钟。
3. 倒掉或吸走滤液，即可用于样品浓缩。

Q8：离心力（RCF）和离心时间如何设置？

A：

• 离心力（RCF）：应严格参照产品说明书。过高的 RCF 可能会压实膜上的大分子，造成膜堵塞（“膜污染”），甚至损坏膜结构。常见的 RCF 范围在 3000g 到 7000g 之间。
• 离心时间：没有固定值，应根据所需的浓缩倍数和 RCF 调节。应多次短暂离心（如 5-15 分钟/次），而不是一次长时间离心，以便实时检查浓缩体积，防止过度浓缩。

Q9：超滤时，是否需要保持低温？

A： 是的。 离心过程中产生的摩擦热可能会导致蛋白质变性或降解。特别是对于热敏性蛋白或长时间离心，建议在 4°C 冷藏离心机中进行操作。

Q10：如何进行脱盐或缓冲液置换？

A： 这是通过洗滤（Diafiltration）方法实现的：

1. 将样品浓缩至目标体积。
2. 向浓缩后的样品中加入等体积或多倍体积的新缓冲液。
3. 再次离心，将新缓冲液中的旧盐分/小分子挤出。
4. 重复步骤 2 和 3 2-3 次，可以达到 1:100 到 1:1000 的置换效果。

Q11：浓缩后的样品如何从超滤管中回收？

A： 回收是样品损失的“重灾区”。

1. 将超滤管底部收集管倒置或移除。
2. 将超滤装置倒置，放入一个干净的接收管中。
3. 以低速离心（例如 1000g，2 分钟），将浓缩液从滤膜上方反向离心出来。
4. 也可以用微量移液器轻轻吸取，但要避免接触或划伤滤膜。

三、故障排除与优化篇（Q12-Q15）

Q12：为什么超滤流速非常慢，甚至堵塞了？

A： 常见原因：

1. MWCO 选择过小：膜孔径太小，导致目标分子或聚集物堵塞。
2. 样品浓度过高或存在颗粒物：样品中的悬浮物或脂类堵塞了膜孔。
3. 离心力过高：将膜压实。

解决： 离心前先用 0.22 m 滤器过滤样品；降低离心 RCF；或更换更大 MWCO 的超滤管。

Q13：为什么我的目标蛋白回收率很低（样品损失大）？

A： 主要原因：

1. 非特异性吸附：膜材料对目标蛋白有吸附性，尤其在高分子量和低蛋白浓度时更明显。
2. MWCO 选择不当：目标蛋白部分穿滤（漏掉）。
3. 过度浓缩：浓缩体积小于最小回收体积。

解决： 润洗时加入少量 Tween}-20$（非离子去污剂）；在缓冲液中加入 BSA（牛血清白蛋白）或甘油作为竞争性保护剂；严格避免过度浓缩。

Q14：离心后，为什么我的蛋白样品变浑浊了？

A： 很可能是蛋白质在浓缩过程中变性或聚集。

1. 原因可能是浓缩倍数太大，导致局部蛋白浓度过高，超过溶解度。
2. 离心过程中温度过高。

解决： 减少单次浓缩倍数，分步进行；使用低温离心；在缓冲液中加入甘油、精氨酸等稳定剂。

Q15：超滤管使用时有没有什么容易忽略的小技巧？

A：

• 平衡离心：每次离心必须在离心机内放入一个等体积水的配平管，以保证离心平衡。
• 预装缓冲液：如果样品体积很小（如 < 50 L），可以在超滤管中先加入少量缓冲液，以增加有效体积，避免样品直接接触膜表面而过度吸附。
• 避免干燥：超滤膜一旦干燥，可能永久失去其性能。如果操作中断，应在膜表面覆盖一层缓冲液。

💡 总结

离心超滤是提高样品质量和浓度的重要手段。通过理解 MWCO 的原理，精细控制 RCF 和温度，并做好预润洗和回收步骤，你就能最大限度地提高目标分子的回收率，确保后续实验的顺利进行。