在分子生物学和蛋白质组学研究中，了解蛋白质之间的相互作用对于揭示细胞内各种生物学过程的机制至关重要。GST pull-down 实验是一种常用的技术，用于检测和鉴定蛋白质之间的物理相互作用。本文将详细介绍 GST pull-down 实验的原理和步骤。

二、实验原理

GST pull-down 是在体外验证两种蛋白质结合的方法之一，其原理是目的蛋白与GST融合表达，蛋白固定在谷胱甘肽（GSH）亲和树脂上，作为与目的蛋白亲和的支持物，起到“诱饵蛋白”的作用。 目标蛋白溶液通过柱子，从中可以捕获相互作用的“捕获蛋白”（目标蛋白）。结合物洗脱后，通过蛋白质印迹 (WB) 分析证实了两种蛋白质之间的相互作用。

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三、实验步骤

GST-诱饵蛋白融合物的制备

– 通过基因工程技术将诱饵蛋白与 GST 融合表达。可以使用合适的表达载体和宿主细胞进行蛋白质表达和纯化。

– 纯化 GST-诱饵蛋白融合物，确保其具有较高的纯度和活性。可以使用谷胱甘肽琼脂糖珠进行亲和纯化。

谷胱甘肽琼脂糖珠的准备

– 取适量的谷胱甘肽琼脂糖珠，用缓冲液洗涤几次，以去除杂质和未结合的谷胱甘肽。

– 将洗涤后的谷胱甘肽琼脂糖珠悬浮在适当的缓冲液中，备用。

GST-诱饵蛋白融合物与谷胱甘肽琼脂糖珠的结合

– 将纯化的 GST-诱饵蛋白融合物与谷胱甘肽琼脂糖珠在适当的缓冲液中孵育一段时间，使 GST-诱饵蛋白融合物结合到谷胱甘肽琼脂糖珠上。

– 通过离心或过滤的方法去除未结合的 GST-诱饵蛋白融合物，并用缓冲液洗涤谷胱甘肽琼脂糖珠，以去除未结合的杂质。

蛋白质样品的制备

– 准备含有可能与诱饵蛋白相互作用的蛋白质的溶液。可以是细胞裂解液、纯化的蛋白质混合物或体外表达的蛋白质。

– 为了减少非特异性结合，可以对蛋白质样品进行预处理，如去除核酸、调整离子强度等。

GST pull-down 实验

– 将含有 GST-诱饵蛋白融合物的谷胱甘肽琼脂糖珠与蛋白质样品在适当的缓冲液中孵育一段时间，使与诱饵蛋白相互作用的蛋白质结合到 GST-诱饵蛋白融合物上。

– 通过离心或过滤的方法去除未结合的蛋白质，并用缓冲液洗涤谷胱甘肽琼脂糖珠，以去除未结合的杂质。

蛋白质复合物的洗脱和分析

– 使用适当的洗脱缓冲液将结合在谷胱甘肽琼脂糖珠上的蛋白质复合物洗脱下来。洗脱缓冲液的选择应能够破坏 GST-诱饵蛋白融合物与谷胱甘肽琼脂糖珠之间的结合，但不影响蛋白质之间的相互作用。

– 洗脱下来的蛋白质复合物可以通过各种方法进行分析鉴定，如 SDS-PAGE 电泳、Western blot、质谱分析等。这些方法可以确定与诱饵蛋白相互作用的蛋白质的身份、相对丰度以及结合特性。

四、注意事项

诱饵蛋白的选择：选择合适的诱饵蛋白是实验成功的关键。诱饵蛋白应具有明确的生物学功能和较高的纯度，并且其与猎物蛋白的相互作用应该是已知或预期的。

蛋白质样品的质量：蛋白质样品的质量对于实验结果至关重要。应确保蛋白质样品具有较高的纯度和活性，并且没有被污染或降解。

实验条件的优化：实验条件的优化包括孵育时间、温度、缓冲液组成等方面。需要通过预实验来确定最佳的实验条件，以提高实验的灵敏度和特异性。

对照实验的设置：设置适当的对照实验是非常重要的，以排除非特异性结合和其他干扰因素的影响。例如，可以使用没有 GST-诱饵蛋白融合物的谷胱甘肽琼脂糖珠作为阴性对照，或者使用已知相互作用的蛋白质作为阳性对照。

数据分析：对实验结果进行准确的数据分析是得出可靠结论的关键。要注意区分特异性结合和非特异性结合，结合多种分析方法和对照实验，以提高结果的可信度。