qPCR（实时荧光定量PCR）实验需要注意以下多个方面：

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样本处理

• 样本采集：确保采集的样本能代表研究对象，采集过程要迅速，防止RNA降解或DNA变化，如采集组织样本时应立即放入液氮或RNA保护剂中。

• 核酸提取：选择合适的提取方法和试剂盒，保证核酸纯度和完整性，避免蛋白、盐离子等杂质残留，提取后可通过琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测评估质量。

• 核酸保存：提取的核酸若不能及时使用，应置于-80℃保存，避免反复冻融，RNA需特别注意防止降解。

引物与探针设计及选择

• 引物设计：长度一般为18-25bp，GC含量40%-60%，上下游引物Tm值相差不超过5℃，避免引物二聚体和发卡结构，通过BLAST分析确保特异性。

• 探针选择：若使用探针法，探针的Tm值应比引物高5-10℃，5’端不能为G碱基，荧光基团和淬灭基团选择要合适，且与仪器检测通道匹配。

反应体系配置

• 试剂质量：选用高质量的qPCR试剂，包括DNA聚合酶、dNTPs、缓冲液等，关注试剂的保质期和保存条件。

• 体系比例：按照试剂盒说明书精确配置各成分比例，如模板、引物、探针、酶等的浓度要准确，Mg²⁺浓度对反应影响较大，需优化。

• 避免污染：配置体系应在专门的洁净区域，使用带滤芯的枪头，避免试剂间交叉污染，可设阴性对照监测污染情况。

仪器操作与实验条件设置

• 仪器校准：定期对qPCR仪器进行校准和维护，检查荧光检测系统等是否正常，确保结果准确可靠。

• 反应程序：根据引物、模板和试剂特点优化反应程序，包括预变性、变性、退火、延伸的温度和时间，尤其退火温度需通过预实验确定。

• 加样操作：加样要准确、快速，避免产生气泡，确保反应体系均匀，加样后及时放入仪器，防止样本长时间放置影响结果。

数据分析

• 标准曲线制作：标准曲线的相关系数应大于0.99，斜率在-3.1至-3.6之间，以保证定量准确性，标准品浓度梯度要合理。

• 结果重复性：实验应设置生物学重复和技术重复，变异系数（CV）一般应小于15%，若结果重复性差，需查找原因重新实验。

• 阈值设定：阈值应设定在荧光信号指数增长期，且要保持一致，避免因阈值设定不同影响结果分析。