瞬时转染（Transient Transfection）是一种将外源DNA、RNA或蛋白质短暂导入细胞的技术，外源遗传物质不会整合到宿主基因组中，通常在转染后24-72小时内达到表达高峰，随后逐渐降解。这种方法广泛应用于基因功能研究（如启动子活性分析、siRNA/mRNA敲降或过表达）、蛋白生产（如抗体瞬时表达）和CRISPR基因编辑（如sgRNA/Cas9的短期作用）等实验。其核心优势在于操作快速、无需筛选稳定细胞系，但表达时间较短（一般不超过1周）。

操作步骤

一、实验前准备

1. 材料与试剂

1）细胞：对数生长期的HEK293T/HeLa等（活力＞95%，汇合度70-80%）

2）质粒DNA：高纯度提取（A260/A280=1.8-2.0，浓度≥1μg/μL）

3）转染试剂：Lipofectamine™ 3000（或PEI Pro™ 2025新版）

4）培养基：Opti-MEM（无血清）及完全培养基

2. 设备校准

1）生物安全柜（风速≥0.5m/s）

2）37℃ CO₂培养箱（湿度＞90%）

二、标准化操作流程

1. 细胞铺板（转染前24小时）

用完全培养基将细胞接种于6孔板（2×10⁵ cells/孔），确保转染时汇合度达90%

关键点：避免细胞过密（易导致毒性）或过稀（转染效率低）

2. 转染复合物制备

静置15分钟形成纳米级复合物（粒径＜200nm）

3. 转染

1）吸除旧培养基，用PBS轻柔洗涤1次

2）加入1mL Opti-MEM（无血清）

3）逐滴加入转染复合物（边加边摇晃培养板）

4. 孵育

1）常规细胞：37℃ 4-6小时后换完全培养基

2）敏感细胞（如原代细胞）：2小时后换液

5. 检测时间窗

注意事项

1. 细胞状态控制

1）使用对数生长期细胞（汇合度70-80%），活力＞95%（台盼蓝检测）。

2）敏感细胞（如原代细胞、神经元）需预铺板24小时，转染前换无抗生素培养基。

2. 核酸质量与比例

1）质粒DNA需高纯度（A260/A280=1.8-2.0），避免内毒素污染（LAL检测＜0.1EU/μg）。

2）比例优化：

DNA:脂质体 = 1:2~1:3（Lipofectamine 3000）

siRNA:转染试剂 = 1:1~1:5（RNAiMAX）

3. 血清干扰规避

转染时使用无血清培养基（如Opti-MEM），换液时间根据细胞耐受性调整（常规4-6小时，敏感细胞2小时）。