外泌体作为细胞间通讯的关键载体，其鉴定是研究的基础。国际细胞外囊泡学会（ISEV）明确规定，外泌体鉴定需满足 “三重验证”：透射电镜（TEM）观察形态、纳米颗粒追踪分析（NTA）检测粒径与浓度、Western Blot（WB）验证标志物。这三种方法从形态、物理特性和分子标志物三个维度交叉验证，确保外泌体的真实性和纯度。本文详细解析每种方法的核心原理、关键步骤及结果判断标准。

外泌体结构，来源：百度

一、透射电镜（TEM）：观察外泌体的“形态身份证”

1. 核心原理：电子束穿透成像，捕捉纳米级结构

透射电镜利用高能电子束穿透样本，通过电子与样本原子的相互作用（散射、吸收）形成明暗对比图像。外泌体具有双层磷脂膜结构，直径30-150nm，在电镜下呈典型的“茶托状”或“杯状”形态，这是区分外泌体与其他囊泡（如微囊泡）或蛋白聚集体的关键依据。

2. 技术要点：负染增强对比度，凸显膜结构

• 样本制备：外泌体悬液经22μm滤膜过滤（去除细胞碎片），滴于碳支持膜铜网上，用 2%磷钨酸（负染剂） 染色——负染剂沉积在囊泡周围，使低电子密度的膜结构呈现“亮边暗核”的清晰轮廓。
• 观察参数：加速电压80-120kV，放大倍数10,000-100,000×，需拍摄多个视野确保代表性。

3. 结果判断：认准“双层膜+茶托状”典型形态

• 阳性特征：双层膜结构完整，直径30-150nm，形态为圆形、椭圆形或一侧凹陷的“茶托状”。
• 排除标准：无膜结构的不规则颗粒（蛋白聚集体）、直径＞200nm的微囊泡或背景中的盐结晶。

4. 为什么TEM是金标准？

电镜是唯一能直接观察外泌体形态的方法，尤其对“双层膜”的识别是其他技术无法替代的，可有效排除非囊泡杂质，确保样本的真实性。

 

二、纳米颗粒追踪分析（NTA）：测量外泌体的“物理特征码”

1. 核心原理：追踪布朗运动，计算粒径与浓度

NTA基于光散射和布朗运动 原理：在显微镜下，外泌体因布朗运动（分子热运动）随机移动，通过相机实时记录颗粒运动轨迹，结合 Stokes-Einstein方程 计算每个颗粒的流体力学直径，并统计粒径分布和颗粒浓度。

2. 技术要点：动态追踪，兼顾精度与效率

• 样本稀释：外泌体悬液需稀释至 1×10⁸-1×10⁹ particles/mL，确保视野中颗粒无重叠，轨迹可清晰追踪。
• 检测参数：激光波长488nm，温度25℃（恒温控制），每个样本检测3次，取平均值以减少误差。

3. 结果判断：粒径分布30-150nm，浓度与纯度关联

• 粒径分布：主峰需落在30-150nm范围内，且90%颗粒直径＜200nm（如图1B），这是外泌体的核心物理特征。
• 浓度指标：报告颗粒数/mL（如1×10¹⁰ particles/mL），需结合蛋白浓度计算 “颗粒/蛋白比”（理想值＞1×10¹¹ particles/mg），比值过低提示蛋白污染。

4. 为什么NTA不可替代？

NTA能同时提供粒径分布和浓度 数据，反映外泌体的均一性和产量，是评估提取效率和样本质量的关键指标。

 

三、Western Blot（WB）：验证外泌体的“分子标志物”

1. 核心原理：抗体特异性识别，验证标志性蛋白

外泌体携带特定蛋白标志物，WB通过 “电泳分离-抗体结合-显色检测” 流程，验证这些标志物的存在：

– 跨膜蛋白：CD9、CD63、CD81（四跨膜蛋白家族，参与囊泡形成）；

– 腔内蛋白：TSG101（ESCRT复合体成分，调控外泌体生物发生）、ALIX（辅助囊泡释放）；

– 阴性对照：Calnexin（内质网蛋白，检测细胞碎片污染，外泌体样本应 Calnexin阴性）。

• 技术要点：多标志物联合验证，排除污染
• 蛋白提取：外泌体沉淀用RIPA裂解液（含蛋白酶抑制剂）裂解，提取总蛋白。
• 抗体选择：需同时检测 2种以上阳性标志物（如CD63+TSG101）和1种阴性标志物（Calnexin），确保结果可靠性。

2. 结果判断：阳性条带清晰，阴性对照无信号

• 阳性结果：CD9、CD63、CD81、TSG101等条带清晰，分子量与理论值一致（如CD63约53kDa）。
• 纯度验证：Calnexin无条带，证明无细胞碎片污染（如图1C）。

3. 为什么WB是“身份验证”关键？

外泌体的功能依赖其分子组成，标志物检测可排除非外泌体囊泡（如凋亡小体），同时证明样本的生物学活性。

 

三种方法联合使用：构建外泌体鉴定“铁三角”

ISEV指南强调，单一方法无法全面鉴定外泌体，需三种方法联合验证：

– TEM 证明形态特征（“长得像外泌体”）；

– NTA 确认物理特性（“大小和数量符合外泌体标准”）；

– WB 验证分子标志物（“具有外泌体的蛋白特征”）。