📌 **做ELISA，99%的错误都出在“细节”上。**看似简单的加样、孵育、显色、读数，实际上每一个步骤都藏着数据波动的隐患。今天就来手把手捋清楚，从样本准备到最终读数，每一步该怎么做，才能让你的数据稳准狠，文章能顺利发！

🎯 什么是ELISA？一句话总结👇

**酶联免疫吸附试验（ELISA）**是一种基于抗原-抗体专一性结合反应，通过酶标二抗与底物作用显色，检测目标分子浓度的经典方法。广泛应用于细胞培养上清、血清、血浆、组织匀浆、尿液等样本的定量检测。

📦 样本篇：稳定性就是一切

✅ 样本采集

• 血清/血浆：采血后30 min内离心，-80℃冻存，避免反复冻融。
• 细胞培养上清：收集后立即离心去除细胞碎片，速冻保存。
• 组织匀浆：统一匀浆浓度和条件，离心取上清，避免蛋白酶降解。

📌 Tips：同一实验中尽量用同一批样本，或随机化分组，避免批次效应。

🧪 加样篇：细节决定数据线性

✅ 标准品配制

• 一律用推荐稀释液，现配现用，确保浓度准确。
• 逐级稀释法，避免直接倍比稀释造成误差。

✅ 样本加样

• 每孔体积一致，常见100 μL。
• 加样动作稳、准，避免气泡。
• 建议平行复孔，减少偶然误差。

📌 Tips：提前预演操作顺序，避免多孔板反应时间不统一。

⏳ 孵育篇：时间温度要到位

• 严格按照说明书时间孵育，不可凭经验提前或延后。
• 保持恒温（常见37℃或室温，按试剂盒要求）。
• 孵育期间避免剧烈晃动，平放孵育箱。

📌 Tips：同一实验使用统一型号的孵育设备，防止温差影响反应效率。

🎨 显色篇：终点读数的灵魂

• 底物显色液需避光保存，现配现用。
• 显色时间严格计时，不同孔板不能共用显色计时。
• 加终止液后，立刻读数，防止颜色继续发展。

📌 Tips：显色均匀，孔内无气泡，否则数据偏移。

📊 读数篇：设好参数，读准数据

• 常见450 nm波长，带630 nm或570 nm校正背景。
• 每孔读数3次取平均值。
• 标准曲线R²>0.99，异常点需剔除。

📌 Tips：用同一台酶标仪完成整板读数，减少仪器间差异。

🔍 数据整理篇：别让小细节毁了统计

• 样本编号规范，结果表清晰，便于溯源。
• 平行孔OD值偏差>10%，应排查加样或显色异常。
• 坚持每次实验记录原始数据，防止后期出错。

📌 ELISA常见问题排查速查表

📖 总结一句话：

ELISA做好，靠的不是运气，是对每一个操作细节的尊重。
只要你把样本、加样、孵育、显色、读数这五关细节卡住，数据稳稳的，文章自然不缺好图好表！