实验室新到的菌种冻干粉，如何才能高效复苏并确保活性？作为微生物实验的”第一道门槛”，菌种复苏的每一个步骤都可能影响后续实验的成败。本文基于《微生物菌种保藏与复苏技术规范》及一线实验经验，详细拆解冻干粉复苏的全流程，涵盖安瓿瓶开启、菌悬液制备、培养条件控制、活性验证等关键环节，附厌氧/真菌等特殊菌种的处理技巧，新手也能一次成功。

 

一、复苏前准备：材料、环境与安全核查

1. 核心材料清单

2. 环境与安全准备

• 无菌环境：超净台提前紫外灭菌30分钟，操作前用75%酒精擦拭台面及双手，开启风机10分钟后开始操作
• 生物安全：二级及以上菌种需在生物安全柜内操作，佩戴手套、护目镜，实验废弃物需灭菌后丢弃
• 预实验核查：确认菌种说明书中的关键参数（培养温度、需氧/厌氧、最适pH、培养时间），如”长双歧杆菌：37℃厌氧培养48h，营养琼脂培养基”

 

二、关键步骤：冻干粉复苏标准化操作流程

步骤1：安瓿瓶开启——避免污染与活性损失

1.单层安瓿瓶开启法：

（1）用75%酒精棉反复擦拭安瓿瓶表面（重点颈部），垂直固定于支架上

（2）酒精灯外焰灼烧安瓿瓶颈部（距顶端1cm处）3-5秒，迅速滴加1-2滴无菌水至灼烧处，利用热胀冷缩原理使瓶颈破裂

（3）用无菌镊子轻轻敲下顶端，避免玻璃碎片掉入瓶内（若有碎片，需用无菌吸管吸取菌悬液，避免直接倾倒）

2.双层安瓿瓶开启法：

直接旋开外层塑料盖，检查内层玻璃管底部干燥剂颜色（蓝色为真空，无色/粉红需弃用），其余步骤同单层瓶

来源：百度

 

步骤2：菌悬液制备——让”沉睡”的菌种苏醒

1.液体重悬：用1mL无菌吸管吸取0.5-1mL预热至37℃的液体培养基（厌氧菌需用厌氧预处理培养基），缓慢注入安瓿瓶，轻轻吹打3-5次，使冻干粉完全溶解（无肉眼可见颗粒）

特殊菌种处理：

真菌：加入5-6mL无菌水，室温静置2-4小时（延长孵育可提高孢子萌发率）

放线菌：加入含0.05%吐温-80的生理盐水，涡旋混匀1分钟打散菌丝体

 

2.菌悬液转移：将全部菌悬液转移至15mL无菌离心管，若安瓿瓶内有残留，可用少量培养基冲洗2次，合并至离心管

 

步骤3：接种与培养——模拟菌种”原生环境”

接种方法选择：

培养条件控制：

• 温度：严格按说明书设置（如大肠杆菌37℃，酵母菌28℃，嗜热菌55℃），温差不超过±1℃
• 时间：细菌18-24h，真菌48-72h，放线菌5-7天，每天观察生长情况（避免培养过久导致老化）
• 厌氧控制：厌氧菌株需在厌氧仓内完成接种，培养时放入厌氧指示剂（美蓝变无色为合格厌氧环境）

步骤4：活性验证——确保复苏菌株”身份正确”

1. 生长观察：

• 液体培养：观察是否浑浊、有无菌膜/沉淀（大肠杆菌呈均匀浑浊，枯草芽孢杆菌可能形成沉淀）
• 固体培养：记录菌落形态（大小、颜色、边缘、隆起度），与标准图谱比对（如金黄色葡萄球菌为圆形、金黄色、边缘整齐的菌落）
  2. 初步鉴定：
• 革兰氏染色：取单菌落涂片，革兰氏阳性菌呈紫色，阴性菌呈红色（如枯草芽孢杆菌G+，大肠杆菌G-）
• 生化试验：快速糖发酵管（如大肠杆菌发酵乳糖产酸产气，沙门氏菌不发酵乳糖）
  3. 分子鉴定：
• 挑取单菌落提取DNA，进行16S rRNA基因（细菌/古菌）或ITS序列（真菌）PCR扩增，产物送一代测序
• 测序结果与NCBI数据库比对，相似度≥99%为目标菌种

三、特殊菌种复苏技巧：厌氧、真菌与难培养菌株

1. 厌氧菌株：全程”无氧”是关键
   • 操作环境：从安瓿瓶开启到接种，所有步骤需在厌氧工作站内进行（氧气浓度＜1%）
   • 培养基预处理：液体培养基需煮沸10分钟驱氧，冷却后加入还原剂（如1%半胱氨酸）
   • 培养验证：用厌氧培养箱培养，同时设置有氧对照组（若有氧组生长，提示厌氧操作失败）

2. 真菌孢子：延长复苏时间，促进萌发

• 菌丝体分离：冻干粉加入无菌水后，用玻璃珠涡旋30秒打散孢子团，过400目筛网去除大颗粒
• 温度敏感型：如酵母菌需25℃培养，避免37℃高温抑制生长；霉菌需保持培养箱湿度＞80%（可放置水盘）
• 避光培养：光敏感性真菌（如某些担子菌）需用黑布包裹培养皿，防止光照抑制孢子萌发

3. 难培养菌株：添加”生长促进剂”

• 营养缺陷型：在基础培养基中补充特定氨基酸（如组氨酸缺陷型需加L-组氨酸终浓度50μg/mL）
• 寡营养菌：用稀释10倍的营养肉汤培养，减少代谢产物抑制（如土壤寡营养细菌）
• 休眠孢子：加入萌发剂（如枯草芽孢杆菌加5mg/L MnSO₄·H₂O，促进芽孢萌发）

四、复苏后处理：保藏、扩培与应急方案

1. 菌种保藏：延长活性，避免退化

• 短期保藏（1-3个月）：

• 斜面保藏法：取活化后的单菌落，用接种环在固体斜面培养基上划”S”形线条，37℃培养18-24h（细菌）或48h（真菌），待菌落长成后，4℃冰箱保存。
• 注意事项：每月转接1次，防止培养基干燥或菌种老化；真菌斜面可滴加1-2mL无菌液体石蜡覆盖，隔绝空气延长保存至3-6个月。
  • 中期保藏（6-12个月）：
• 甘油管冻存：取对数期菌液（OD600=0.6-0.8），与50%甘油按1:1混合（终浓度20%甘油），分装至2mL无菌冻存管，-80℃保存。
• 适用场景：大多数细菌、酵母菌，冻存前需标记菌种名称、编号、冻存日期及传代数（建议使用≤5代的菌种，避免遗传背景改变）。
  • 长期保藏（5年以上）：
• 冷冻干燥保藏：将对数期菌液与保护剂（如10%脱脂牛奶）混合，分装安瓿瓶后冷冻干燥，真空封口，-20℃保存（需专业设备，适合菌种库长期保藏）。

2. 扩大培养：从单菌落到足量菌液
   • 液体扩培流程：
3. 挑取活化后的单菌落，接种至5mL液体培养基（如LB、营养肉汤），37℃摇床180rpm培养12-16h（细菌）或28℃培养24-48h（真菌），至对数期（OD600=0.6-0.8）。
4. 按1:100比例转接至100-500mL新鲜培养基，相同条件培养至目标浓度（如大肠杆菌发酵至OD600=2.0时，菌量约1×10⁹ CFU/mL）。
   • 关键控制：

• 严格控制转速（厌氧菌需静置培养，真菌需低速摇床50-100rpm避免菌丝断裂）；
• 监测pH值（可通过添加缓冲剂或补加培养基维持最适pH，如乳酸菌培养需加碳酸钙中和酸性代谢物）。

3. 复苏失败应急方案：排查原因，精准解决