细胞侵袭实验：如何判断细胞是否“穿”过去了？
在肿瘤研究和药物开发中，细胞侵袭实验是评估细胞迁移和侵袭能力的关键技术。无论是研究癌细胞的转移机制，还是筛选抗肿瘤药物，科研人员都需要准确判断：细胞是否真的“穿”过了基质屏障？
一、什么是细胞侵袭实验？
细胞侵袭实验通常采用Transwell小室（也称Boyden小室）进行。这套系统分为上下两个室，中间由一层多孔聚碳酸酯膜隔开。膜上涂有基质胶（Matrigel），模拟体内的细胞外基质屏障。
上室接种待测细胞，下室加入化学引诱剂（如胎牛血清或特定趋化因子）。如果细胞具有侵袭能力，它们会分泌酶降解基质胶，穿过膜上的微孔，到达膜的下表面。
细胞侵袭实验示意图（图片来自百度）
二、如何判断细胞是否侵袭过去？
- 直接计数法（金标准）
实验结束后，取出Transwell膜，固定并染色（常用结晶紫、吉姆萨或DAPI等染料），然后在显微镜下直接计数穿过的细胞。
具体步骤：
– 取出Transwell膜，用PBS轻轻清洗
– 用棉签轻轻擦去膜上表面未侵袭的细胞
– 用4%多聚甲醛固定膜下表面的细胞
– 使用0.1%结晶紫溶液染色10-20分钟
– 用清水轻轻冲洗并晾干
– 在光学显微镜下随机选择多个视野计数细胞
- MTT比色法
对于高通量筛选，可采用MTT比色法进行间接定量。原理是MTT被活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶还原为不溶性的紫色甲臜结晶，结晶溶解后可通过酶标仪测定吸光度值。
优点：适合大规模实验，客观性强
缺点：无法观察细胞形态，可能受到细胞增殖影响
- 荧光标记法
用荧光染料（如Calcein-AM）预标记细胞，细胞穿过膜后，使用荧光酶标仪直接检测下室中的荧光强度，定量分析细胞侵袭数量。
进阶应用：表达荧光蛋白（如GFP）的稳定细胞系可使检测更加简便，无需染色步骤。
三、提高实验准确性的关键技巧
- 设置对照实验
– 阳性对照：使用已知高侵袭能力的细胞系（如MDA-MB-231乳腺癌细胞）
– 阴性对照：使用低侵袭能力的细胞系（如MCF-7乳腺癌细胞）
– 空白对照：下室不添加趋化因子，评估随机迁移
- 优化实验条件
– 基质胶浓度要适中（通常1-2 mg/mL）
– 细胞接种量要优化（通常5×10^4-1×10^5细胞/孔）
– 培养时间要恰当（通常24-48小时）
- 避免常见错误
– 擦除上表面细胞时要轻柔且彻底，避免假阳性
– 膜孔堵塞会影响结果，需确保细胞悬液无团块
– 注意气泡问题，气泡会阻碍细胞迁移
四、数据分析与结果解读
细胞侵袭实验的结果通常表示为：
– 穿膜细胞数（每视野）
– 侵袭细胞百分比（相对于总细胞数）
– 侵袭指数（实验组/对照组）
统计时需至少重复3次独立实验，每次设3个复孔，采用t检验或ANOVA进行统计分析。
五、进阶技术：实时监测细胞侵袭
传统Transwell实验只能提供终点数据，而新型技术如xCELLigence实时细胞分析系统可以动态监测细胞侵袭过程，提供更丰富的动力学数据。
六、结语
准确判断细胞是否侵袭过去是细胞侵袭实验的核心。通过优化实验条件、设置合理对照、采用适当的检测方法和严谨的数据分析，研究人员可以获得可靠的结果，为肿瘤转移机制研究和抗肿瘤药物开发提供有力支持。
科学研究在于细节，每一个步骤的精心设计都可能影响最终结果的可靠性。掌握这些关键技术点，让你的细胞侵袭实验更加精准可信！