常用蛋白浓度检测方法全解析
在生物科研领域，准确测定蛋白质浓度是一项基础且关键的工作，它对于后续的实验结果准确性和可靠性起着至关重要的作用。以下为你介绍几种常用的蛋白浓度检测方法，包括其原理、实验步骤、注意事项，并进行方法对比。
一、双缩脲法
- 原理
双缩脲是由两分子尿素缩合而成的化合物，在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色络合物，此反应即为双缩脲反应。含有两个或两个以上肽键的化合物都具有双缩脲反应，其颜色深浅与蛋白质的浓度成正比。
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- 实验步骤
- 准备不同浓度的蛋白质标准品和待测样品。
- 向各管中加入双缩脲试剂，充分混匀。
- 室温放置一段时间，使反应充分进行。
- 使用分光光度计在特定波长下测定各管的吸光度。
- 根据标准品的吸光度绘制标准曲线，通过标准曲线计算待测样品的蛋白质浓度。
- 注意事项
- 标准物质必须使用代表性很强的样品，需使用其他参考方法测出标准物质中的蛋白质总含量，故测定工作费力费时。
- 不宜测定样品种类多、彼此差异大的样品。常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。
二、Lowry法
- 原理
Lowry法是双缩脲法与福林酚法的结合与发展。包括两步反应，第一步是在碱性条件下，双缩脲试剂（碱性铜试剂）可与蛋白质中的肽键发生显色反应，生成蛋白质 – 铜络合物；第二步是此络合物将Folin试剂（磷钨酸和磷钼酸混合液）还原成钼蓝和钨蓝混合物而呈蓝色反应，颜色深浅与蛋白质含量成正比。
来源：百度
- 实验步骤
- 准备蛋白质标准品和待测样品。
- 向各管中加入双缩脲试剂，混匀后室温放置一段时间。
- 加入Folin试剂，迅速混匀。
- 室温放置一段时间，使反应完全。
- 用分光光度计在特定波长下测定吸光度。
- 根据标准曲线计算待测样品的蛋白质浓度。
- 注意事项
- 耗费时间长，操作时间需精准控制，标准曲线绘制麻烦。
- 专一性较差，干扰物质比较多，如含有嘌呤、嘧啶、核酸等吸收紫外光的物质会干扰测定。
三、BCA法
- 原理
BCA与二价铜离子的硫酸铜等其他试剂组成的试剂混合一起即成为苹果绿，即BCA工作试剂。在碱性条件下，BCA与蛋白质结合时，蛋白质将Cu2 + 还原为Cu +，工作试剂由原来的苹果绿色变为紫色复合物。562nm下其光吸收强度与蛋白质浓度成正比。
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- 实验步骤
- 配制BCA工作液：根据标准品和样品数量，按50体积试剂A，1体积试剂B配制适量BCA工作液，充分混匀。
- 将蛋白标准品按梯度加入96孔板的蛋白标准品孔中，加灭菌双蒸水补足到一定体积。取适量待测样品加入96孔板的待测样品孔中。每个测定要做2 – 3个平行。
- 向待测样品孔和蛋白标准品孔中各加入BCA工作液，混匀。
- 37℃温浴30min，冷却至室温。
- 酶标仪562nm波长下测定吸光度。
- 制作标准曲线，从标准曲线中求出样品浓度。
- 注意事项
- 长期不用时，Cu试剂与PBS稀释液可置于2 – 8℃保存，如发现细菌污染则应丢弃。BCA试剂在低温条件下出现结晶沉淀时，可37℃温育使其完全溶解，不影响使用。
- 样品中若含有较多干扰物质时，请采用Bradford蛋白浓度测定试剂盒。
- 为了安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。常用浓度的去垢剂SDS、TritonX – 100、Tween不影响检测结果，但受螯合剂（EDTA，EGTA）、还原剂（DTT，巯基乙醇）和脂类的影响。
四、Bradford法
- 原理
考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量测定微量蛋白浓度快速、灵敏的方法。考马斯亮蓝G – 250染料具有红色和青色两种色调，在酸性溶液中游离状态下为棕红色，当它通过疏水作用与蛋白质结合后变成蓝色，使染料的最大吸收峰的位置由465nm变为595nm，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。
- 实验步骤
- 准备蛋白质标准品和待测样品。
- 向各管中加入Bradford试剂，混匀。
- 室温放置2 – 5分钟。
- 在595nm波长下测定吸光度。
- 根据标准曲线计算待测样品的蛋白质浓度。
- 注意事项
- 由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考马斯亮蓝染色法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g – 球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。
- 仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、TritonX – 100、十二烷基硫酸钠（SDS）等。
五、紫外分光光度法
- 原理
蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基的苯环中含有共轭双键，因此，蛋白质具有吸收紫外光的性质，其最大吸收峰位于280nm附近。在最大吸收波长处，吸光度与蛋白质溶液的浓度服从郎伯 – 比尔定律。
- 实验步骤
- 准备蛋白质标准品和待测样品。
- 使用分光光度计在280nm波长下测定标准品和待测样品的吸光度。
- 根据标准曲线计算待测样品的蛋白质浓度。
- 注意事项
- 测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，含有嘌呤、嘧啶、核酸等吸收紫外光的物质会干扰测定。
- 适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。
六、方法对比列表
